DMi8與轉化醫學研究
——如何為您的研究選擇和配置顯微鏡
 
新冠也許是人類已知的作為危險的病毒之一，其傳播力強、途徑隱秘危害性大，而面臨如此大敵，多虧了核酸檢測技術發展才可以使其無所遁形。但是核酸檢測技術首先都需要對核酸中的信號進行放大，以新版的國家新冠指南中所描述，需要將收集到的DNA進行35個循環的擴展后才可以用于檢測，這個參數雖然較之之前的40個循環有所減少，但是放大倍數也有2³⁵之多，可以想象如果中間有任何錯誤都會被放大如此高的倍數。怎么樣才能測得準確呢？標準品是關鍵的保證之一。
面對新冠的核酸檢測方案中的標準品，上海交通大學的樊春海院士在此方面做出了最關鍵的貢獻。2020年初在他主持下的國家轉化醫學科學中心積極支持下，上海市計量院與交大的聯合團隊夜以繼日攻關，僅用42天及時研發出新冠核酸標準物質——GBW（E）091111和GBW（E）091112，并經國家緊急授權于2020年3月19日獲批，為核酸試劑盒提供計量溯源和質量控制依據，供百余家研制單位使用，為疫情防控做出重要貢獻和基礎保障。擁有170年光學技術沉淀的徠卡顯微系統也非常有幸能為樊院士的研究提供力所能及的支持。
 
圖片轉載自“上海科技”公眾號，作者：一諾
工欲善其事必先利其器，在成就偉大的科研成果之前，對設備的配置選擇是首要因素之一。光學顯微鏡通常是生命科學研究實驗室的主要設備之一。它可在多種應用中幫助解開科學謎團。因此，從明場顯微鏡到熒光顯微鏡和活細胞成像，顯微鏡的配置和功能對于其應用范圍至關重要。
 
 
 
您研究什么樣本？
選擇研究顯微鏡時，首要的考慮因素是研究的樣本類型。如果是放置在薄載玻片上的固定樣本，您可以選用正置顯微鏡。活細胞檢測則需要使用顯微鏡的特殊功能，因為它們是放在充滿細胞培養液的大細胞培養容器中。
 
 
圖1：左：放置固定樣本的載玻片，例如組織切片。右圖：用于細胞培養的有蓋培養皿。
只有物鏡在樣本下方而聚光鏡在樣本上方的倒置配置，才能提供基本的自由空間和物鏡與樣本之間的接近度。與此同時，倒置顯微鏡還可以很好地接近細胞，例如添加顯微操縱器。
此外，活細胞需要適當的環境才能生存。溫度和二氧化碳濃度必須保持在一定水平。完成這項任務需要一個帶有相應控制器的氣候室。
 

 
圖2：左：正置顯微鏡的特點是物鏡在樣本上方，聚光鏡在樣本下方。右：倒置顯微鏡的設置恰好相反，主要是為了向用戶提供更多空間以及物鏡與樣本之間所需的接近度。
 
您認為是在哪些維度？
顯微樣本展開成三個維度：長度、寬度和高度。一些樣本，例如組織切片，僅在xy方向上成像，而其他應用可能也需要在z方向上進行采集。成像3D體積，例如，對于活細胞，建議使用電動物鏡轉盤，它能夠逐步引導您的樣本通過焦點。成像軟件應該能夠重建單個圖像以進行3D可視化。
對于活細胞，您必須添加時間維度。在這種情況下，系統穩定性便是另一個關鍵特性。由于在采集過程中溫度變化會影響成像系統，因此必須采取有效的應對措施。自適應對焦控制（AFC）等自動對焦調整可消除這些熱影響，并始終找到預定義的焦點。
 

圖3：自適應對焦控制（AFC）也可以在長時間延時采集期間自動穩定顯微鏡焦點。傳感器檢測到LED光束（850 nm）的運動，如果載有樣本的蓋玻片改變其位置，例如由于熱活動，就會發生這種運動。
 
哪種對比方法適合您的樣本？
用顯微鏡研究的大多數細胞——尤其是動物細胞——沒有足夠的內在對比度來讓研究人員觀察細節。研究人員使用對比方法來解決這個問題。相襯（PH）和微分干涉對比（DIC）可操縱穿過樣本的光以增加對比度，您也可以分別使用熒光蛋白通過熒光染料（免疫熒光）對其進行染色。
根據對比方法，顯微鏡需要特定的設備；例如相襯需要特殊的物鏡，而DIC使用某些必須切換到光路中的棱鏡。對于熒光顯微鏡，您需要特殊的熒光濾色塊，以促使正確的光波長進入和退出樣本。
 
 
圖4：用不同對比方法獲得的一系列神經元細胞。從左到右：明場、DIC、相襯、熒光
 
光源呢？
對比方法的選擇也決定了光源。用于傳統明場顯微鏡、相襯和DIC的透射光照明可以使用鹵素或LED照明進行。熒光顯微鏡可以通過LED照明或在汞燈、氙燈或汞金屬鹵化物燈的幫助下進行。
 
您想記錄或發布您的結果嗎？
如果您想拍攝樣本圖像或進行活細胞成像，則需要一個數碼顯微鏡攝像頭。特別是在熒光活細胞成像的情況下，建議使用靈敏的攝像頭，以盡量減少可能傷害細胞的激發光量。除了成熟的CCD和EMDDC攝像頭外，如今的sCMOS攝像頭也因其高量子效率和采集速度而得到應用。有關數碼顯微鏡攝像頭的更多信息，請閱讀文章“數碼攝像頭技術簡介”。
此外，大視野（FOV）有助于更快地找到感興趣的區域并同時成像更多細胞。現代研究顯微鏡的攝像頭端口具有19毫米FOV，與19毫米sCMOS攝像頭芯片匹配。
通常，僅拍攝樣本圖像是不夠的，還需要分析您獲得的數據。為此，易于使用的成像和分析軟件有助于獲取定量數據并進行可靠的數據分析。
 
您是否需要采集厚樣本的（3D）信息？
厚樣本對顯微鏡檢查來說是一個挑戰。尤其是寬場顯微鏡在同時照亮整個樣本的情況下，來自焦點外區域的額外光會顯著減少焦點內的樣本特征。
成像解析可以幫助獲得沒有失焦光的圖像。該技術可以應用于單個圖像平面以獲得即時結果（ICC：即時成像解析），或者可以與額外的反卷積步驟（SVCC：小容量成像解析；LVCC：大容量成像解析）以獲得更好的結果。反卷積將光子信息重新分配給它們的起源，從而在焦平面中提供更好的所需結構對比度。與傳統的寬場圖像相比，這可以讓用戶更容易地將感興趣的結構與背景區分開來。
 

圖5：癌組織中的單分子RNA-FISH。RNA-01（綠色）、RNA-02（品紅色）左：原始數據。中：使用即時成像解析。右圖：大容量成像解析之后。由蘇黎世大學（瑞士）的Andreas Moor教授提供。
 
您想在顯微鏡上操作細胞嗎？
在過去的幾年里，樣本的圖像處理變得日益普遍。這意味著研究人員不僅要觀察活細胞，還要借助光來操縱它們。光漂白后的熒光恢復（FRAP）是有助于了解動態細胞過程的一個示例。對于這些類型的操作技術，通常需要額外的光源，這些光源必須集成到顯微鏡的光路中。
這種方法并非易事。徠卡無限端口是一種通用解決方案，可將附加光源耦合到顯微鏡的光路中，而不會影響圖像質量，例如：FRAP、光開關、消融或光遺傳學。有了合適的適配器，研究人員甚至可以連接他們的自制設備。
 
 
圖6：徠卡WFFRAP模塊（左側黑框）可通過無限端口與倒置研究顯微鏡徠卡DMi8連接。
 
您的預算是多少？
一個重要的問題是您可以投入的資金。一些顯微鏡供應商提供適合特殊應用的預定義配置。但是，如果您不需要所有付費的預配置組件怎么辦？這就是為什么免費配置組件比購買預定義的顯微鏡系統更經濟的原因。
此外，對顯微鏡的要求可能會隨著時間而改變。在這種情況下，可升級系統具有一定的優勢。通過預定義和固定的配置，您會發現僅需有限數量的應用程序。可升級性讓您可以根據不斷變化的需求靈活配置。
考慮到這些因素，徠卡DMi8等模塊化顯微鏡平臺可以使研究人員從經濟的顯微鏡系統入門，然后隨著需求的增長而不斷升級。
 
 
圖7：利用模塊化設計，徠卡DMi8可以根據研究人員的需要進行配置。此外，如果需求發生變化，后期還可以進行升級。
 
誰使用顯微鏡？
顯微鏡用戶的范圍可能差異很大。尤其是在大學，用戶可能非常有經驗，也可能是絕對的初學者。因此，由徠卡應用套件X(LAS X)等直觀軟件運行的易于使用的顯微鏡系統有助于人們快速入門并快速獲取數據。例如，面向工作流的設計、圖像分析向導以及將外圍設備無縫集成到系統中可以簡化您的工作。
除了寬場研究顯微鏡外，體視顯微鏡也經常用于生命科學研究實驗室。您可以在“選擇體視顯微鏡時要考慮的因素”一文中了解更多信息。
 

了解更多：徠卡顯微